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蛋白印迹实验（WB）

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项目介绍

WB（Western Blot，蛋白质印迹法）实验是基于抗原-抗体特异性结合的特性来检测特定蛋白质的一种蛋白质检测技术。基本原理是经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

样品要求

1、新鲜样品：1、100mg（至少）新鲜组织，干冰运输；

2、细胞：细胞类型样本细胞数为1-2*10⁷以上，收集细胞后PBS清洗三遍，离心去除上清，干冰运输；

3、血液样品：样品无潜在性携带病原体和病毒。如果存在病毒的可能性，请灭活处理；

（1）全血：采集新鲜血液，建议全血样品用全血样品RNA提取试剂盒抽提RNA，或者新鲜血液分离白细胞；处理后的样本放入干冰或者﹣80℃冰箱保存，干冰运输寄送。

（2）血浆：用EDTA等抗凝剂处理后的样本，4℃ 4000rpm离心5分钟，上层为血浆样本，按每200µl血浆样本加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，涡旋摇匀，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰运输寄送。

（3）血清：用非抗凝管收集血样，静置分离上层血清，按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，涡旋摇匀，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰运输寄送。

4、蛋白样品：未变性的蛋白需要存入-80°C ，干冰运输寄送；Loading Buffer煮沸的蛋白，需要提供蛋白浓度(浓度需在5μg/μl 以上，200μl样品)，冰袋运输寄送。

5、植物组织样品：选取新鲜组织，200mg以上组织，尽量避免衰老，病变，发霉的组织；将样品剪成小块放入液氮预冷的螺口离心管中，在液氮中速冻5min，-80度保存，干冰运输寄送。

6、菌体：收集菌体到1.5ml的离心管内，离心去上清，用1*pbs洗涤三次，液氮速冻5min后，-80度保存。

项目案例

常见问题

1、1、为什么蛋白质印迹条带大小与预期的不同？

答：蛋白质印迹是一种基于蛋白质大小来分离蛋白质的技术。一般来讲，蛋白质越小，在胶上的迁移速度越快。但迁移速度也受其它因素的影响，因此，观察到的实际条带大小可能与预测的不同。

常见的因素包括：

1.翻译后修饰：例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白质大小。

2.翻译后切割：例如许多蛋白先被合成为前蛋白，然后被切割产生活性形式，例如前半胱天冬酶。

3.剪接变体和异形体：可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。

4.相对电荷-氨基酸（带电和不带电）多聚体组分，例如蛋白质的二聚化。这种情况通常在还原条件下需要防止，但强相互作用会导致较大的条带出现。

2、2、蛋白样本为什么要进行还原和变性？

答：为了使样本被还原和变性，样品缓冲液中会含有十二烷基硫酸钠(SDS)和β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。SDS是一种变性剂，用来打破蛋白的高级结构，变成初级的氨基酸结构，同时以恒定的质量比包被蛋白质，使其带上负电荷。这一恒定的负电荷比是下一步凝胶电泳分离的关键。β-巯基乙醇和DTT都是还原剂，用来断开蛋白自身的二硫键，进一步使蛋白质变成线性结构，此图中简单地展示了这一过程。顺便提一下，有些抗体只能够识别目标蛋白的天然结构，在这种情况下，样本不需要被还原和变性。所以还原和变性的步骤可以省略。但是，大多数蛋白质印迹分析都需要在还原和变性的体系中进行。

3、3、为什么检测重组蛋白时难以获得条带？

答：抗体检测重组蛋白质时，存在难以克服的困难，有必要加以考虑。所以推荐确保样品中表达的重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。同时，如果重组蛋白带有标签，标签可能阻止抗体接近表位。尽可能让标签位于重组蛋白的C或N末端，以降低这种情况发生的可能性（而不是位于蛋白质的阅读框中间）。

4、4、牛奶和 BSA 封闭有区别？

答:抗体可能对封闭剂敏感，一般来讲，BSA会产生更清晰的结果，因为BSA含有较少的蛋白，因而抗体较少与其发生交叉反应。但并非总是如此，有些抗体在牛奶中的效果更好，因为牛奶含有更多种类的封闭蛋白，能封闭更多不同类型的蛋白质。

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