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实时荧光定量PCR

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项目介绍

检测各类样品，如动植物组织、细胞液、全血等样品中目标基因的存在以及相对含量。

实验流程：取材-RNA提取-测浓度-逆转录成cDNA-qPCR检测-数据分析-发报告

样品要求

1. 请提供已知的全长基因序列和详细背景资料：DNA/RNA来源，丰度；

2. 请您提供新鲜的且尽量多的材料，或直接提供纯化好的总RNA或DNA（大于5ug/样本）。

3. 动物组织：样本离体应当立即放入液氮或-80℃冰箱中速冻保存，避免反复冻融，并且样本在-80℃的保存时间不宜过长，若保存时间超过半年应及时与工作人员取得联系，组织寄送100mg以上，脂肪组织，结缔组织，纤维化组织适当增加，干冰运输；

4.植物：新鲜的叶、果肉、种子等最少需100mg，干冰运输。

5.细胞：1×10^6个细胞，加入trizol的细胞样本（不要直接运输加trizol的细胞培养皿），Trizol 为裂解液，不适用于组织样本的保存，细胞除外，干冰运输；

6.全血：最少1 mL新鲜血液EDTA抗凝管，4度运输；血清：最少1 mL，干冰运输；

7.RNA样品： OD260/280为1.8-2.0，浓度≥100 ng/μL，体积≥20μL，干冰运输；cDNA：cDNA原液≥20 μL，干冰运输；

8. 对于完成实验后，剩余样本需要返还的项目，需在收到项目完整版结题报告一个月内告知公司，逾期样本将安排清理。如果样本特别珍贵，需提前说明。一般情况下，样本不予返还；样本返回需要客户承担返还费用（包括干冰费和快递费）。

注意事项：在装样品的EP管上面做好标记，并且样本命名应与《项目送样单》保持一致，并在送样时用密封袋装好；因样本试提取或检测均会消耗部分样本，所以送样样本量需至少高于上述提及样本量的三分之一，建议所有样本均做好备份；

项目案列

内参基因ACTIN（扩增曲线）

内参基因ACTIN(溶解曲线)

内参基因COL1(扩增曲线)

内参基因COL1（溶解曲线）

COL1目的基因组柱状图

常见问题

1.无Ct值出现

检测荧光信号的步骤有误:一般SybrGreen法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

1、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。

2、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

3、模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2.Ct值出现过晚（Ct>38）

1、扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

2、PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

3、PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。

3.溶解曲线不止一个主峰

1、引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

2、引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

3、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。

4、模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

4.扩增效率低

1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

2、反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

3、反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

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