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【详解】HE染色实验中的常见问题及其处理方法

来源：时间：2024-12-06 10:23:25 浏览：5409次

【详解】HE染色实验中的常见问题及其处理方法

HE染色（苏木精-伊红染色）是组织学、胚胎学和病理学中最常用的技术之一，用于观察细胞核和细胞质的结构；然而，在实际操作中，常常会遇到各种问题，影响染色结果的质量。

一、基本原理

HE染色法利用苏木精（碱性染料）和伊红（酸性染料）分别对细胞核和细胞质进行染色。苏木精主要使细胞核内的染色质和细胞质内的核酸着紫蓝色，而伊红则使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。通过这种染色方法，可以清晰地观察到细胞的结构和组织的形态。

二、常见问题及处理方法

（1）着色过深或过浅

1. 原因：染色时间控制不佳，HE染色需要通过镜检来控制时间，染色时间过长或过短都会影响染色效果；分化时间不当，过度分化会导致染色太浅，而分化不足则会使染色过深。

2. 处理方法：通过预实验确定最佳染色时间，一般情况下新鲜苏木素染色时间在1-3分钟，分化时间不宜过长；如果染色过深，可以适当缩短苏木素染色时间，或增加分化时间；如果染色过浅，可以适当延长苏木素染色时间，或减少分化时间；过度分化后，可以用水洗后重新复染苏木素。

（2）染色不均

1. 原因：切片厚度不一，切片有褶皱或裂痕，导致过厚或过薄的部分在染色时吸收染液的程度不同；染色时间不足或过长；脱蜡水化不充分；试剂分布不均匀。

2. 处理方法：提高切片技术，确保切片厚度均匀，厚度一般在3-5微米，切片过程中避免产生刀痕和褶皱；严格按照标准时间进行染色；脱蜡前确保玻片干透，严格按照标准时间把控二甲苯停留时间（二甲苯110分钟、二甲苯110分钟）；在染色过程中适当晃动切片，确保试剂均匀分布。

（3）染色后切片不清晰，雾化，斑点

1. 原因：烤片温度过低，时间不够，导致脱蜡不彻底，切片留存白色斑点；染色后切片脱水时间不合理，切片上残留水分，使切片雾化；盖玻片上残留封固剂，导致切片不清晰；组织标本已发生自溶或取材后没及时固定或固定液浓度不够；固定剂对组织有一定媒染作用，固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因；淋巴结处理不当造成切片染色后组织见发灰现象，主要原因是细胞密集，结构复杂，导致固定液难以渗透到组织深部。

2. 处理方法：提高烤片温度和时间，确保脱蜡彻底；优化脱水的梯度乙醇时间，切片经过低浓度时时间要短，向高浓度逐渐延长脱水时间；重新封片，确保盖玻片上没有残留封固剂；及时固定组织标本，确保固定液浓度合适；对于淋巴结等复杂组织，可以用等量无水乙醇乙醚混合液处理切片5-10分钟，乙醇洗，水洗，3%硫酸铁铵溶液补充媒染5分钟。

（4）染色后切片有黑色杂质，气泡

1. 原因：杂质多为苏木素染色液中的金属膜粘附于载玻片上；封片过程中产生的气泡。

2. 处理方法：每天染色前仔细过滤苏木素染液，或使用半氧化苏木素染色液；仔细检查封片过程，确保没有气泡产生。可以使用中性树脂进行封片，防止日后褪色。

（5）细胞核染色过浅

1. 原因：苏木精染色时间不足，未能使细胞核充分摄取染料；分化时间过长，导致细胞核染色过浅。

2. 处理方法：适当延长苏木精染色时间，确保细胞核充分染色；减少分化时间，避免过度分化。

（6）细胞质染色不佳

1. 原因：伊红染色时间不足，未能使细胞质充分摄取染料；伊红染色液中的pH值不合适。

2. 处理方法：适当延长伊红染色时间，确保细胞质充分染色；在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸，调节pH值，改善细胞质染色效果。

（7）组织切片收缩、变形

1. 原因：染色过程中切片干燥：导致切片收缩、变形，影响神经元形态。

2. 处理方法：在染色过程中保持切片湿润，避免切片干燥；切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

（8）封片问题

1. 原因：封片时使用的树脂浓度不当，可能导致日后褪色；盖片选择不当，如漏出一部分组织块，将会导致褪色。

2. 处理方法：使用中性树脂进行封片，防止日后褪色；选择大于组织块面积的盖片，确保没有部分组织块漏出；确保树脂浓度适中，封片时没有气泡。

三、实验注意事项

1. 缓冲液的使用：组织切片在染色前必须在适当的缓冲液中浸泡，染色期间pH值应始终稳定。

2. 固定时间：如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色，需要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30分钟。

3. 分色时间：切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚而细胞质基本无色为佳。

4. 脱水和透明化：组织切片需要通过一系列的酒精浓度逐渐脱水，并用透明剂如苯酚、二甲苯等进行透明化；透明化后切片会变得更加清晰，便于染色。

5. 洗涤步骤：未充分清洗会导致染色剂残留，影响结果的质量；每个处理步骤后，应该用足够的缓冲盐水彻底洗涤。

6. 避免空气暴露：空气中的灰尘和污染物会对实验产生不利影响，因此在染色过程中，需要避免将切片长时间暴露在空气中，并保持实验室的清洁和卫生。

7. 监控染色反应：染色的过程应该密切监测，以便在必要时进行微调；需要管理好每个步骤的时间和温度，以避免过度染色或染色不足的情况发生。

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