热线：400-152-6858
显微成像
结构分析
成分分析
物性分析
热学性能
声光电磁
材料加工
原位测试
力学性能
环境试验
显微成像
病理检测
细胞实验
微生物实验
动物实验
测序平台
蛋白实验
分子及生化
分子互作平台
代谢组学平台
蛋白组学平台
临床前CRO
生物信息学平台
单细胞组学
整体课题服务
药物筛选平台
第一性原理
分子动力学
量子化学
CAE仿真
更多服务
超算服务
原位变温/气氛/光照测试
原位电化学测试
原位力学测试
吸收
散射/衍射
原位
成像
光谱
微区
论文翻译
数据分析
基金标书
文库百科WB实验中的转膜与抗体结合步骤详解
来源： 时间：2024-01-08 09:59:01 浏览：2282次
WB实验中的转膜与抗体结合步骤详解
蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）是一种检测蛋白质表达水平和分子量的技术，WB实验包括样品制备、SDS-PAGE电泳、转膜、抗体结合及显色等多个步骤。
一、转膜
转膜是将SDS-PAGE电泳分离后的蛋白质转移到固定在固相支持物上的过程，转膜方法有向上毛细管转移、向下毛细管转移、电转移和真空转移等；固相支持物主要有硝酸纤维素膜和尼龙膜，硝酸纤维素膜是非共价结合，易脆，而尼龙膜是带正电荷的，高强度，不易破损，具有较大的DNA结合容量，在转膜过程中，需要将分离胶上的蛋白质完全转移到膜上，以便后续的抗体结合和检测。
二、抗体结合
抗体结合是WB实验的核心步骤，主要包括一抗孵育、洗涤、二抗孵育和洗涤等过程。
1. 一抗孵育：将特异性一抗添加到转膜后的膜上，孵育过程中一抗与目标蛋白质发生结合，一抗的浓度和孵育时间需要根据实验需求进行调整；一般情况下，一抗的浓度在1:1000-1:10000之间，孵育时间为1-2小时，在孵育过程中，需要保持膜的湿润，可以使用封闭液或抗体稀释液进行湿润。
2. 洗涤：用缓冲液（如TBST）反复洗涤膜上未结合的一抗，洗涤的次数和时间需要根据实验情况进行调整，一般洗涤3-5次，每次5-10分钟；洗涤的目的是去除未结合的一抗，避免后续的显色反应受到干扰。
3. 二抗孵育：将与一抗匹配的二抗加入到膜上，孵育过程中二抗与一抗结合，二抗的浓度和孵育时间也需要根据实验需求进行调整；一般情况下，二抗的浓度在1:1000-1:10000之间，孵育时间为1-2小时，同样需要保持膜的湿润。
4. 洗涤：用缓冲液（如TBST）反复洗涤膜上未结合的二抗；洗涤的次数和时间需要根据实验情况进行调整，一般洗涤3-5次，每次5-10分钟。
三、注意事项
1. 在转膜过程中，需要控制好转膜电压和时间，以及膜的湿度和尺寸，避免影响蛋白质的转移效率。
2. 在抗体结合过程中，需要注意一抗和二抗的浓度和孵育时间，避免过度或不足结合。
3. 洗涤步骤是去除未结合抗体的重要环节，需要充分洗涤，避免背景杂乱。
4. 实验过程中需要保持膜的湿润，避免膜干燥影响抗体结合。
5. 在显色过程中，需要均匀涂抹ECL显色液，避免显色不均。
相关文章
一文详解扫描电子显微镜(SEM)的工作原理及应用技术
2023-10-08
接触角测试（CA）的原理、样品制备要求及实际应用
2023-11-16
热重分析（TG-DTG）曲线的几种解析方法
2023-12-26
恒电流间歇滴定法GITT的基本原理以及测试教程
2022-08-12
TMA技术的基本概念、应用领域以及实际操作中的要点
2023-12-06
一文详细介绍he染色的基本原理、实验步骤及注意事项
2023-11-23
项目推荐/Project
蛋白质免疫印迹实验（WB）
热门文章/popular
基础理论丨一文了解XPS（概念、定性定量分析、分析方法、谱线结构）
手把手教你用ChemDraw 画化学结构式：基础篇
晶体结构可视化软件 VESTA使用教程（下篇）
【科研干货】电化学表征：循环伏安法详解（上）
电化学实验基础之电化学工作站篇 （二）三电极和两电极体系的搭建 和测试
【科研干货】电化学表征：循环伏安法详解（下）
