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    一文解读热分析巨头:等温量热滴定仪
    来源: 时间:2023-06-28 09:30:01 浏览:10791次

    提起热分析技术,大家最先想起的必然是热重分析/差热分析/差示扫描量热法“三巨头”,这三种热分析技术广泛应用于材料、物理、化学等领域的研究中。然而再经典的测试技术总有鞭长莫及的地方,分析技术的空白需要源源不断的新技术来填充。今天,小GO就给大家介绍一种主要用于生物学领域研究的微量热仪器——等温滴定量热仪(isothermal titration calorimetry,ITC)。ITC可以通过检测样品池补偿功率的变化,以参加反应的物质总浓度变化和反应的热量变化为函数,并结合一定的数学模型获取热力学参数。一次ITC实验即可计算出结合常数(KA)、解离常数(KD)、结合化学计量比(Δn)、焓变(ΔH)和熵变(ΔS)等热力学参数。高灵敏度、高自动化的等温量热滴定仪能够原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息,是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法。

     

    1 等温量热滴定仪[1]




    1. 工作原理

    在ITC仪中,有两个加样池,一个是含有水的参比池,另一个是包含目标蛋白质的样品池,二者之间通过一个热电偶回路相连,确保样品池和参比池处于完全相同的温度(图2a)。样品池和参比池侧分别有一个加热器,在实验过程中分别对样品池和参比池进行加热,实验过程中加热器的功率补偿会被同步记录下来并用于后续的热分析,具体的操作流程如下:

    ① 在参比池中加入参比物,将反应物置于样品池中,将参比池和样品池设置为所需的实验温度;

    ② 将含有配体的滴定剂(通常是小分子)装入注射器并加入样品池,一系列的小份配体等分试样被依次注入到目标反应物的蛋白质溶液中;

    ③ 样品与滴定剂发生吸热/放热反应会导致样品池与参比池的温差发生变化,反应变化的能量被热敏装置灵敏的检测到,灵敏度可达到百万分之一摄氏度;

    ④ 每注入一份配体滴定剂后,量热仪都会进行一次测量,所测得的热量与反应结合量成正比;

    ⑤ 以放热反应为例,注入配体后与样品发生反应,样品池的温度高于参考池,仪器记录下降峰信号,加热装置对参考池供给更多的热量,等到两侧温度恢复一致之后,信号峰就返回到起始位置;

    ⑥ 经过一系列配体注射,配体和样品之间的摩尔比逐渐增加,样品中的活性成分越来越少,反应结合量减少,每注入一份配体后的热量变化也在减小,直到最终样品池中的样品饱和,热量变化趋近为零;

    ⑦ 等温量热滴定仪将一系列的变化数值记录下来,即可获得量热曲线(图2b);

    ⑧ 将每个峰的面积进行积分,并以配体与样品的摩尔比为横坐标进行绘图,生成的等温线(热量峰曲线,图2c)可用于拟合计算得出焓ΔH,结合拟合方程可获得亲和力KD,结合等温线中心的摩尔比可以获得反应化学计量数。

    等温量热滴定仪工作原理[3]


    1.1 量热滴定or滴定量热?

    ITC的中文名主要有“等温量热滴定仪”和“等温滴定量热仪”两种,这是根据它的测试原理和流程命名的。总的来看,ITC的测试流程主要分为两部分:功率补偿和谱图分析。ITC的实验数据以热谱图形式表示,它提供了有关反应中物质的量(滴定终点)和反应物质的特性(变)的数据。对图进行分析,可以得知反应容器中发生的反应的类型和数目,以及溶液中存在的各物种的浓度等信息。这部分内容称为热滴定。同时还可以确定反应的化学计量关系,计算反应的热力学量如平衡常数K(ΔG°)、标准状态下的焓变ΔH°和熵变ΔS°这部分内容称为滴定量热法[4]


    1.2 为什么可以用微量热法研究分子间相互作用?

    分子间相互作用过程中价键的形成和破坏需要释放或者吸收能量,绝大部分化学和生化过程也都伴随着热量的吸收和释放,这是ITC仪测试分析的根本原理。微量热检测的是最基本、最普遍的物理量-热量变化,这是ITC仪的测试原理。仪器灵敏度的提高让检测mcal或者ncal水平的热量成为可能,样品的用量也随着仪器设计的进步而减少到可以接受的程度,这是ITC仪实现微量研究的原理。被分析的样品始终处于天然的溶液状态和构象,无需修饰。测试过程非光学检测,样品颜色、内在荧光、透明度对实验没有影响。热量测定可以在广泛的溶液环境和温度条件下进行,这是ITC仪能对广泛的样品进行测试分析的原理。



    2. 样品制备要求

    (1) 缓冲液要求

    a. 为了降低背景热,实验需要的两种分子的缓冲液必须一致;

    b. DMSO的稀释热非常高,因此需要样品池与滴定针里的DMSO浓度高度一致;

    c. pH值的微小差异也会引起很高的稀释热,因此建议提前用透析液稀释样品;

    d. 还原剂会引起显著的基线漂移和假阳性,特别是当焓变很小的时候。可用TCEP代替β-Me和DTT,浓度尽可能的低于1mM;

    e. 建议提前对缓冲液脱气,可有效减少气泡,提高数据质量。

    (2) 样品要求

    a. 一次实验需要的体积:≥ 350 µL 蛋白(样品池);≥ 60 µL 配体 (滴定针);

    b. 可尝试的初始浓度:5-50 µM 蛋白 (至少 10x Kd);50-500 µM 配体 (≥10x 样品池浓度);

    c. 测试前要对样品做离心或过滤处理,并精确测定样品的摩尔浓度。

    (3) 减少误差

    a. 样品池中的浓度误差会影响 stoichiometry,滴定针中的浓度误差会直接影响KD,ΔH和n;

    b. Protein aggregates 会干扰ITC实验;

    c. 可用光散射评价蛋白的均一性,纯化的蛋白样品如果有可溶性的聚集可以通过 size-exclusion chromatography 去除;

    d. 试验前后要使用缓冲液对装样针、样品池、参比池进行润洗。

    (4) 样品前处理

    a. 准备约50mL的缓冲溶液(用来润洗样品池及注射器,或者实验结束后先用缓冲溶液清洗样品池);

    b. 将样品(滴定物和被滴定物)及上述的缓冲溶液一起放入degassing station 脱气处理;

    c. Degassing station 设置温度(测试滴定实验温度),真空度400mmHg以上,脱气时间10min。




    3. 应用范围

    蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用);蛋白质折叠/去折叠;蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用;酶促反应动力学;药物-DNA/RNA相互作用;RNA折叠;蛋白质-核酸相互作用;核酸-小分子相互作用;核酸-核酸相互作用;生物分子-细胞相互作用[5]




    4. 技术优势

    1) 无需标记:直接测定最普遍的热量变化,无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰;

    2) 在一次ITC实验中可以获得有关结合反应的大量信息,有助于了解相互作用的性质并探索其热力学驱动因素;

    3) 非特异性:基本上兼容任何缓冲或添加剂。测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系,对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件;

    4) 样品用量小,方法灵敏度和精确度高。仪器最小可检测热功率2 nW,最小可检测热效应0.125 μJ,生物样品最小用量0.4 μg,温度范围2 - 80 ˚C,滴定池体积小(1.43 ml);

    5) 响应速度快,测试时间短:一次实验时间只需30-60分钟;

    6) 操作简便:整个实验由计算机控制,使用者只需输入实验的参数,如温度注射次数、注射量等,计算机就可以完成整个实验,再由Origin软件分析ITC得到的数据,易上手,人工误差小;

    7) 无损性:测量时不需要制成透明清澈的溶液,而且量热实验完毕的样品还可以进行后续生化分析;

    8) 非特异性:生物体系本身具有特异性,因此ITC这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果,这有助于发现新现象和新规律,特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。



    5. 应用范例

    (1) ITC研究蛋白质-酶的相互作用

    纤维素是地球上最丰富的可再生性自然资源,木质纤维材料生物质的全利用是对于人类来说最为重要的生物技术之一。纤维素酶现在已经被越来越多的应用于工业领域,特别是去垢剂中的应用,因此研究去垢剂和纤维素酶的相互作用及其在去垢剂中的稳定性影响就显得尤为重要。武汉大学生命科学学院的研究者们[6]采用特异性的荧光滴定法结合非特异性的ITC测试法,对阴离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)和绿色木霉纤维素酶的相互作用进行了研究。

    15 ˚C下SDS和纤维素酶结合的ITC曲线和由此拟合的非线性拟合曲线如图3所示。从图3a可以看出,SDS与纤维素酶的结合反应为放热反应,随着SDS浓度从0.35 mmol/L增大到8.2 mmol/L,结合反应趋于饱和,滴定曲线逐渐减小。采用独立结合位点模型模拟出该过程的本征结合常熟、本征摩尔结合焓和纤维素酶的SDS结合位点数分别为Kb=126±23 L/mol,ΔbH0m=-3.49±0.24 kJ/mol和n=42.5±0.7。

    不同温度下SDS和纤维素酶结合的热力学数据列在表1中。从测试结果也可以看出,随着温度的升高,Kb总体上是下降的,但30 ˚C的Kb反而比25 ˚C的数据稍大,这可能是由于SDS结合纤维素酶的亲和力较弱。本文的实验结果表明,SDS结合绿色木霉纤维素酶的亲和力较弱,为较小的放热反应,并伴随着一定程度的熵增,属于焓和熵共同驱动的反应。该结合过程的焓变和熵变强烈地依赖于温度,但其Gibbs自由能几乎与温度无关,表明该结合过程中存在着显著的焓-熵补偿作用。

     

    3 SDS与绿色木霉纤维素酶结合的ITC曲线


    1 SDS与绿色木霉纤维素酶结合的热力学参数

    2) ITC研究糖-蛋白质相互作用

    核糖开关(riboswitch)是位于mRNA非编码区域的RNA元件,可与小分子配体结合导致结构转变,进而调控下游基因的表达。核糖开关aac能够特异性结合氨基糖苷类抗生素,从而调控氨基糖苷类抗生素抗性基因的表达。目前,核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素相互作用的位点和机制尚不清楚。复旦大学生物医学研究院的研究者们使用ITC法对核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素的结合亲和力及结合热力学性质进行了研究,并初步讨论了点突变对相互作用的影响[7]

    RNA与小分子的相互作用需要合适的构象,因此,进行等温滴定实验前需将RNA进行退火处理。实验前RNA溶液在95 ˚C变性5 min,金属浴退火4 h,滴定样品须在4 ˚C下12000 r/min离心10 min去除气泡,随后再进行ITC实验,获得的补偿功率随时间变化的曲线图和反应热随摩尔比变化的曲线图如图4所示。

    4 ITC反应中补偿功率随时间变化的曲线图和反应热随摩尔比变化的曲线图

    图中,链霉素滴定核糖开关aac的反应热曲线呈散点状,表明链霉素不能结合核糖开关aac,西索米星、庆大霉素、G418、奈替霉素、巴龙霉素与核糖开关aac有特异性相互作用;阿米卡星、卡那霉素A、链丝菌素、链霉素、新霉素、新霉胺、核糖霉素与核糖开关aac没有特异性相互作用。对反应热函数用One Set of Sites模型(图2中黑色实线)进行拟合,得到结合反应的焓变、熵变、结合常数和化学计量比,结果表明在与核糖开关aac特异性结合的五种氨基糖昔类抗生素中,奈替霉素与核糖开关aac的结合亲合力最强,为1.68 μmol/L;巴龙霉素与核糖开关的结合亲合力最弱,为13.02 μmol/L。

    根据结合热力学和核糖开关aac的二级结构推断,核糖开关aac与氨基糖昔类抗生素的结合发生在A18和U68之间,核糖开关aac中的A13和A44也影响核糖开关aac与氨基糖昔类抗生素的结合。这些结果对进一步研究核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素相互作用的位点和机制具有重要的参考价值。



    6. 总结

    等温滴定量热法(ITC)是一项可实时、定量、在线和动态描述反应过程的热分析技术,能够给出主客体相互作用的结合常数、解离常数、结合化学计量比、焓变和熵变等热力学参数。该技术具有量热灵敏度高、测量准确、适用范围广、非特异性等优点,可以研究小分子-蛋白质作用、蛋白质-蛋白质相互作用、酶促反应动力学等生物学及药学反应特性,广泛用于研究临床用药相容性、DNA/RNA变异特性、药物制剂等领域。由于ITC的测量依据是检测的是最基本、最普遍的物理量-热量变化,因此检测准确性高,而且仪器检测灵敏度高,是生物学领域最有效的测试分析方法之一。


    参考资料

    [1] https://www.ceshigo.com/sycs/714.html

    [2] https://www.ceshigo.com/article/11243.html

    [3] https://www.bilibili.com/video/av96496262/

    [4] 齐心洁,王玥,王彦晟,方国康,黄迎春.等温滴定量热法在蛋白质-配体相互作用中的应用[J].生物技术通报,2017,33(05): 40-49. DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.006.

    [5] 葛秀杰,高雅,李德兴,葛广路.等温滴定量热仪的校准方法与程序实现[J].仪器仪表学报,2021,42(02): 1-9. DOI:10.19650/j.cnki.cjsi.J2006807.

    [6] 项瑾,梁毅,陈楠.等温滴定量热法和荧光滴定法研究十二烷基硫酸钠与纤维素酶的结合[J]. 化学学报,2003(12): 1949-1954.

    [7] 石会刚,陈东戎.等温滴定量热法研究核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素的相互作用[J]. 生物物理学报,2015,31(03): 241-250.

    [8] 余丹丹,邬瑞光.等温滴定量热技术在药物研究中的应用[J]. 中草药, 2018, 49(22): 5463-5467.

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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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