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稳态/瞬态荧光光谱仪的原理及测试用途

来源：时间：2022-11-28 11:34:55 浏览：9226次

1.引言
在历史进程中，为了推动社会不断发展，各类科学技术前后相继、层出不穷。在众多科学技术类别中，光谱学是通过物质（原子、分子、团族等）对光的吸收与发射来研究光与物质相互作用的一门科学。其中，激光光谱技术按照光谱类型可分为以下几种：吸收光谱、荧光光谱、拉曼光谱、红外光谱等，不同的光谱从不同角度反映了物质的不同特性[1]。
在此，我们先介绍一个概念：何为光致发光？物质在吸收紫外和可见电光的时候，其分子受激跃迁至激发电子态，大多数分子将通过与其它分子的碰撞以热的方式散发掉这部分能量；而另一部分分子以光的形式放射出这部分能量，放射光的波长不同于所吸收辐射的波长，该过程称作光致发光[2]。
光致发光可按延迟时间分为荧光和磷光，其中基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光谱法。由于不同种类的物质有着不同的内部结构和发光性质，因此可以根据荧光光谱对不同种类的荧光物质可以进行定性及定量分析。
图1 爱丁堡FLS980型稳态/瞬态荧光光谱仪
我们常见的稳态/瞬态荧光光谱仪（图1）就是一种基于荧光光谱法原理，用于测定材料发光性能（如，激发光谱、发射光谱、量子产率、荧光强度以及荧光寿命等）的分析仪器，是一种综合型的荧光光谱仪，既可以测得覆盖200～1700 nm波段的紫外可见-近红外光的稳态光谱，同时又可测得瞬态光谱。
2.稳态/瞬态荧光光谱仪的原理
稳态/瞬态荧光光谱仪主要以时间相关单光子计数原理（time-correlated single photon counting）来作为测量荧光寿命的工作基础，该原理简称为“单光子计数（SPC）法”，利用脉冲光源激发样品后，样品发出荧光光子信号，每次脉冲后只记录某特定波长单个光子出现的时间t，经过多次计数，测得荧光光子出现的几率分布P(t)，此P(t)曲线就相当于激发停止后荧光强度随时间衰减的I(t)曲线，这好比一束光通过一个小孔形成的衍射图与单个光子一个一个地通过小孔长时间的累计可得完全相同的衍射图的原理是一样的。
以FS920型稳态/瞬态荧光光谱仪为例，如图2所示。
图2 稳态/瞬态荧光光谱仪原理示意图[2]
以FS920型稳态/瞬态荧光光谱仪为例，在此我们简要介绍一下该仪器的工作原理：
时间相关单光子计数原理（time-correlated single photon counting）作为稳态/瞬态荧光光谱仪测量荧光寿命的工作基础，其简称“单光子计数（SPC）法”，其基本原理是，脉冲光源激发样品后，样品发出荧光光子信号每次脉冲后只记录某特定波长单个光子出现的时间t，经过多次计数，测得荧光光子出现的几率分布P(t)，此P(t)曲线就相当于激发停止后荧光强度随时间衰减的I(t)曲线，这好比一束光通过一个小孔形成的衍射图与单个光子一个一个地通过小孔长时间的累计可得完全相同的衍射图的原理是一样的。
当荧光光谱仪进行工作时，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪。一个激发，一个发射，采用双单色器系统，可分别测量激发光谱和荧光光谱。
3.稳态/瞬态荧光光谱仪的结构
我们以OmniFluo900系列稳态/瞬态荧光光谱仪（图3）为例，简要介绍该仪器的结构组成：
仪器主要由光源及其电源、激发光波长选择器件、样品室、发射光波长选择器件、光电探测器、输出装置、仪器控制和数据获取分析和计算机组成。其中，高亮度复色光源及多波长单色光源、高灵敏度单光子探测器和大容量样品室为核心部件，配合精心优化的激发与发射光路设计，能显著地提高了荧光信号探测的灵敏度。
图3 OmniFluo900系列稳态/瞬态荧光光谱仪的结构框图
4.荧光光谱
稳态/瞬态荧光光谱仪对物质进行测量后的结果以光谱图的形式呈现，通常情况下，荧光光谱包括激发光谱与发射光谱两种（图4），其中[3]：
图4 荧光光谱示意图[2]
（a）激发光谱是荧光强度以激发波长为函数的光谱
激发光谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。
研究分子的激发光谱时，保持激发光强度不变，连续地调谐激发光的波长，并探测在某波长位置上分子发射的荧光强度变化。如测量波长选择在发射强度的峰值处，则所测量得的激发光谱强度最大。通常激发光谱的形状与吸收光谱的形状很相像，因为分子的吸收过程也是它的激发过程。
（b）发射光谱是荧光在发射波长上的强度分布
发射光谱是在某一固定波长的激发光作用下，荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。
测量发射光谱时，激发光的波长和强度均保持不变，用发射单色仪进行波长扫描，记录在不同波长上的荧光强度就得到发射光谱。由于激发态和基态有相似的振动能级分布，而且从基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与第一电子激发态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜像对称关系。
荧光光谱具有以下三个主要特点[2]：
（a）Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间有波长差，发射光谱波长比激发光谱波长长；
（b）发射光谱的形状与激发波长无关；
（c）镜像规则，荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。
从得到的荧光光谱中，我们可以获得以下主要谱参数[1]：
（a）激发光谱和发射光谱：激发光谱与吸收光谱极为相似，呈正相关；吸收光谱与发射光谱呈镜像对称关系；
（b）荧光寿命：去掉激发光后，分子的荧光强度降到去掉激发光时刻荧光强度I0的1/e所需要的时间，称为荧光寿命（如图5）；
图5 荧光寿命示意图[2]
（c）量子产率: 荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一。它表示物质发射荧光的效率，通常用来表示，定义为发射量子数和吸收量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率。
（d）荧光强度：测定荧光的相对强度与一些因素有关。荧光的相对强度可以用式1-1表示：
式中，F---荧光强度，K---仪器常数，---量子产率，I---激发光强度，a---摩尔吸收系数，d---样品池的光径，c---样品的浓度。
5.稳态/瞬态荧光光谱分析的原理与特点
5.1 原理
稳态/瞬态荧光光谱分析是一种基于物质的光致发光现象而产生的荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析方法：
（a）定性分析：不同结构荧光化合物都有特征的激发光谱和发射光谱，因此可以将荧光物质的激发光谱与发射光谱的形状、峰位与标准溶液的光谱图进行比较，从而达到定性分析的目的。
（b）定量分析：在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比：F=Kc。其中，F为荧光强度，c为荧光物质浓度，K为比例系数。这就是荧光光谱定量分析的依据。
值得注意的是，上述关系不适用于荧光物质浓度过高的情况，荧光物质浓度过高，其荧光强度反而降低。
5.2 特点
稳态/瞬态荧光光谱分析具有以下特点[4]：
优点：
（a）灵敏度高；
（b）选择性强；
（c）试样量少、方法简单；
（d）提供较多的物理参数。
缺点：
（a）应用范围不够广泛;
（b）对环境敏感，存在多种干扰因素。
6.仪器功能
稳态/瞬态荧光光谱仪广泛应用于多个领域，主要得益于其能实现多种功能性测试：
（a）能够实现不同类型样品（包括液体，固体，薄膜以及粉末）的激发光谱、发射光谱（200～1700 nm）、同步扫描、动力学光谱、三维光谱的测试；
（b）通过配备紫外可见区多个波段皮秒脉冲激光器以及超连续稳态/脉冲白光激光器，能够实现覆盖紫外可见近红外波段稳态/瞬态激发，能够分别进行荧光寿命、上转换荧光寿命（30 ps～50 μs, 200 nm～1700 nm）和磷光寿命（1 μs～10 s, 200 nm～1700 nm）测试；
（c）利用大口径积分球置于样品仓内，通过直接光路测量绝对荧光量子产量（200 nm～1700 nm）；
（d）能够进行不同温区的变温荧光实验（4 K～500 K）；
（e）配备偏振附件能够实现荧光各向异性测试；
（f）可进一步同显微镜耦合，进行微区稳态瞬态荧光测量、电致荧光测量等。
7.制样要求
使用稳态/瞬态荧光光谱仪对物质进行测量时，首先应确定样品具有荧光/磷光性能，样品应在光激励下发光，否则所有荧光类测试都没有意义！进行测试时的制样要求如下：
（a）常规荧光、磷光、寿命等测试：液体、粉末、薄膜（如果有衬底，请选用硅片等不发光、弱发光衬底）均可，具体而言：
液体要1 mL以上，一般5 mL左右，可能有溶度猝灭、溶剂效应等因素带来的影响，所以浓度根据自己样品情况把控，不做要求；
粉末需要研磨较细，一般需要20 mg以上，需要填满长1 cm、宽0.5 cm、深0.2 cm的槽；
块状或薄膜样品要求基底尺寸在1×1 cm～2×2 cm之间，大约指甲盖大小即可；
（b）变温测试：变温测试都不接受易挥发、易腐蚀的样品，如高温下有危害性需提前告知仪器操作者：
粉末需压成厚度1 mm左右，直径5 mm～1 cm左右的片子；
有衬底的薄膜样品可以直接使用；
液体样品，一定要备注好溶剂是什么、膨胀系数多大（如果膨胀系数过大，低温下迅速结冰，会撑破比色皿）；
（c）绝对荧光量子产率测试：激发波长需≥340 nm；固体样品用硫酸钡作空白样，溶液的样品以溶剂作空白样，所以溶液样品测产率需同时提供溶剂。
8.应用现状
由于稳态/瞬态荧光光谱分析技术具有重复性好、灵敏度高、选择性强等特点，且作为目前分析物质结构与成分的有力手段之一，近年来被广泛应用于工农业、医药卫生和科学研究的各个领域，具体而言包括以下几个方面：
（a）荧光物质的化学结构分析；
（b）有荧光特性成分的定量分析；
（c）测试荧光量子产率；
（d）荧光寿命和磷光寿命测定；
（e）时间分辨荧光光谱测定；
（f）荧光偏振性质测定。
张咏等人[5]利用英国Edinburgh FLS920P型的稳态/瞬态荧光光谱仪，对互为同分异构体的胭脂红、苋菜红分子的吸收光谱和荧光光谱实验检测，得到二者的光谱特性参数，并进行对比。
胭脂红、苋菜红的吸收光谱和荧光光谱如图6所示，其中图6（a）为两种物质的吸收光谱，图6（b）为两种红色素在发射波长450 nm下的激发光谱；图6（c-d）为三维荧光光谱；图6（e-f）为330 nm光激发下两种色素的发射光谱，图中的部分光谱特性参数如表1所示。从中可以看出，胭脂红、苋菜红两种同分异构体的吸收光谱（图6a）线型相似，且都含有251与330 nm的吸收峰；不同之处为它们的最大吸收峰值波长分别为 506和521 nm，因此可以作为两种物质的特征吸收波长。荧光光谱也存在差异，它们的发射波长分别450和421 nm，且在同一波长的激发下，苋菜红的荧光峰值强度明显大于胭脂红，如图6（e-f）所示。
图6 胭脂红与苋菜红的（a）吸收光谱和（b-f）荧光光谱[5]
表1 胭脂红与苋菜红的吸收光谱和荧光光谱特征参数
杨珀等人[6]利用FLS920型稳态/瞬态荧光光谱仪对目标产物QPXF在不同种类的溶剂中进行荧光测试，实验中以365 nm波长激发，目标产物QPXF在DCM、DMF、EA、乙醇和CN（5×10–5 mol/L）中的溶液荧光如图7所示。
从结果中可以看出，QPXF的溶液荧光受溶剂极性影响，在极性小的DCM和EA中为λem = 460 nm的蓝光，在极性大的DMF，ETOH和CN中为λem = 505 nm左右的蓝绿色光。同时，溶液荧光强度随着溶剂极性的增大而减小。
图7 QPXF 在不同溶剂中的荧光图谱[6]
9.结语
利用稳态/瞬态荧光光谱仪可以对具有不同结构的荧光化合物进行定性与定量分析，得益于灵敏度高、试样量少、操作简单等特点，该光谱仪在物理、化学、生物医药等领域被广泛应用，对于推动科学研究的进步具有重要意义！
10.参考文献
[1] 周颖. 超支化聚芴衍生物的稳态/瞬态荧光光谱特性[D]. 西安电子科技大学, 2008.
[2] 【科研方法15】一文带你看懂稳态/瞬态荧光光谱原理与应用
[3] 赵南明，周海梦．生物物理学．高等教育出版社．2000，17：289—293．
[4] 姚文华. 荧光分析仪的原理及其在生化工程上的应用[J]. 医药工程设计, 1991.
[5] 张咏, 陈国庆, 朱纯,等. 胭脂红和苋菜红分子结构与光谱性质的对比研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2015, 35(11):3017-3022.
[6] 杨珀, 钱永, 袁月鹏. 一种新型席夫碱的合成及其紫外线屏蔽性能[J]. 工程塑料应用, 2020, v.48;No.364(02):106-111.

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