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实验笔记丨免疫组织化学染色（IHC）步骤详解

来源：时间：2022-11-02 15:34:07 浏览：2244次

免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）。

包埋组织

在４％多聚甲醛溶液中固定组织48小时后，放入一次性组织包埋盒中脱水，浸蜡后包埋。

修片

修剪石蜡切片，直至将石蜡切片修到大部分组织在切面上。

组化

3.1 蜡块制备

将组织蜡块提前泡到冰水混合物中使其变软，将组织蜡块放在切片机上切出５微米的切片，60°Ｃ烘片１小时。

3.2 脱蜡

１）将切片放到60°Ｃ烘箱中烘片４ｈ以上。

２）在二甲苯I里置入片子，持续0.5 h，再置于二甲苯II，依然持续0.5 h。

3.3 水化

１）通过酒精，浸泡切片，酒精浓度不一，分为７０％、８０％、９０％、９５％、１００％，各浓度浸泡时间也有所差异，前３个浓度都是各自浸泡２分钟，后面两个浓度分别浸泡5分钟、10分钟。

２）最后将片子放到双蒸水中浸泡２min。

3.4 组化

１）封闭处理：选择内源性过氧化物酶阻断剂，处理时间为20 min。

２）用双蒸水浸泡三次，单次时间5 min。

３）抗原修复：准备pH＝6.0的10 nM柠檬酸抗原修复液400-600 ml，把片子放到里面，用保鲜膜封住烧杯口防止沸腾溢出。之后放到微波炉中用高火加热10 min。

４）加热后用双蒸水补齐液面，在微波炉中加热40 min（中低火至解冻之间），每隔10 min用双蒸水补齐液面。

５）修复结束后，放到室温下，使其自然冷却。

６）DDW清洗180＂之后，通过PBS清洗，３分钟／次，进行三次。

７）通过一抗封闭，保持４°Ｃ，第二天进行温度回升，为37°Ｃ，然后通过PBS清洗，持续５分钟。

８）在其中添加反应增强液，然后孵育，室温条件，持续20 min，再通过PBS清洗，３分钟／次，进行三次。

９）加入增强酶标山羊抗小鼠／兔IgG聚合物，然后孵育，室温条件，持续20 min，再通过PBS清洗，3分钟／次，进行三次。

1０）滴加DAB显色液（现用现配、比例1:19），室温孵育2-10 min（根据不同的抗体自行选择染色时间）。用自来水轻轻冲洗掉。

１１）复染：加苏木精染色50 s。用DDW，3 min，PBS，５min X３次。

１２）脱水：将片子依次浸泡到不同浓度的酒精梯度中：７０％，ｌｍｉｎ—８０％，ｌｍｉｎ—９０％，1 ｍｉｎ—９５％Ｉ，５ｍｉｎ—９５％ II ，５ｍｉｎ—１００％Ｉ，５ｍｉｎ—１００％ II，５ｍｉｎ。

１３）透明：利用二甲苯Ｉ、二甲苯 II 进行处理，每次处理持续20 min。

１４）中性树脂封片，中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。

来源：科研日精进

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