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测试表征系列丨一文详解MTT法和CCK－8法测定细胞毒性和增殖的优劣

来源：科学10分钟时间：2021-07-01 14:38:03 浏览：12950次

MTT法检测

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

CCK-8法检测

CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种基于WST-8（水溶性四唑盐，一种类似于MTT的化合物）的细胞增殖与活性检测试剂盒，用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测。在电子耦合试剂存在的情况下，WST被线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的甲臜染料（formazan），甲臜染料直接溶解在培养基中。细胞若增殖越多越快，则培养基的颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，生成甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值（450nm）并进行统计学计算便可以获得细胞毒性相关数据。

CCK-8与MTT比较

（1） CCK-8 试剂盒提供了一种灵敏度高，操作简便，使用安全，重现性好的细胞增殖与活性检测方法。与传统的MTT相比，无需有机溶剂和放射性同位素，步骤少，无损失，结果准确！

（2）MTT 实验生成的甲瓒不是水溶性的，需要使用 DMSO 等有机溶剂溶解后才能检测；而CCK-8法产生的甲瓒是水溶性的，不仅省去了溶解的步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差。

（3）与 MTT 方法相比， CCK-8法线性范围更宽，灵敏度更高。

（4）CCK-8法对细胞无毒性，可以多次测定，选取最佳测定时间。且CCK8法所用试剂在培养基中比 MTT 更加稳定，实验效果重复性好。

（5）MTT 具有毒性，同时其生成的甲瓒需要有机溶剂溶解，溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害，会对操作人员身体造成毒害，WST-8无毒，使用中无需有机溶剂，操作更加安全。

（6）CCK-8试剂盒在 4℃避光可长期保存，使用无需配制，即开即用。MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效。

CCK-8试剂使用方法

一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2、按比例(例如:1/2 比例)依次用培养基等比稀释成细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X 轴)，OD值为纵坐标 (Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(适用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间要一致)。

二、细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液（100µL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37 °C， 5% CO2）。

2、向每孔加入 10 µL 的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。

3、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

4、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。

5、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 µL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增殖-毒性检测

使用方法（以96孔板为例，其他规格培养板按实际情况安排）：

1、在96孔板中配制100µl的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100µl 2000个细胞，细胞毒性实验每孔100µl 5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度等因素决定）。按照实验需要，进行培养（在 37 °C，5%CO2的条件下）预培养24小时。

2、向培养板加入1-10µl不同浓度的待测药物刺激。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。

4、每孔加入10µl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。如果起始的培养体积为200µl，则需加入20µl CCK-8溶液，其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和 CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，则需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

5、在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，对于大多数情况，孵育 1 小时即可。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在 0.5、1、2 和4小时候分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度，如无450nm滤光片，可以使用420-480nm 的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

7、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10µl 0.1M 的 HCL溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

8、注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收可。

活力计算：

细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0 加药） -A（空白）] ×100

A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培养基和 CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度

A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项：

1、使用 96 孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意培养基蒸发：一方面，由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加 PBS，水或培养液；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

2、 CCK-8 检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。

3、建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

4、建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加样，溶液产生气泡，会干扰OD值读数。

5、当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔（100µl 培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2500 个/孔（100µl 培养基），且培养时间可适当延长。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

6、加入CCK-8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或 PH 值变化，建议换用新鲜的培养基。

7、如果没有 450nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490nm 之间的滤光片，但是 450nm 滤光片的检测灵敏度最高。

8、酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

9、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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