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电子顺磁共振波谱仪（上）：仪器原理与应用

来源：测试GO 时间：2021-01-21 18:10:08 浏览：14179次

1引言

1895年，荷兰物理学家Zeeman发现在磁场的作用下，光谱的谱线产生分裂，且谱线分裂程度与磁场强度相关的现象，称为“Zeeman效应”[1]。

2发展历史

图1

电子顺磁共振(Electronparamagneticresonance,EPR)技术是利用未成对电子对顺磁性物质进行化学结构信息分析的波谱学检测法。EPR技术发源于物理学研究，最初用来研究某些复杂原子的电子结构、原子偶极矩与分子结构、晶体结构等问题，后来延伸到了生物化学领域中对有机化合物的分析表征。目前，EPR测试技术已在物理学、化学、生物学、医学、能源科学等许多领域得到广泛应用。值得一提的是，EPR能在不影响反应的前提下，获取正在进行的物理和化学反应中的物质结构信息和动态信息，是一种有效的原位机理解析手段。

1925年，Uhlenbeck等提出电子的磁矩是由电子的自旋运动贡献的。

1945年，Frenkel及其合作者在使用133MHz的交变电磁波照射CuCl2·2H2O样品时检测到了电磁波被共振吸收的信号，从此宣告了“电子磁共振”的诞生。并证明了更高的微波频率和更高的外磁场条件更有利于检测到EPR信号。

1946年，美国哈佛大学的Purcell等在实验室中观测到了“核磁共振”(Nuclearmagneticresonance,NMR)现象。

1952年，Hutchison采用EPR技术获得了第一个有机自由基的波谱结果，是首次将EPR技术应用在非物理学领域，并引起了化学家、生物学家和医学家的广泛关注。

20世纪50年代，磁共振谱仪得到了极其快速的发展。60年代末，由于低温技术、原位检测和自旋捕捉等新型实验技术的发展，磁共振谱仪的仪器结构得到了极大的改良和发展，应用范围得到进一步拓广。

3理论基础

3.1磁共振原理

原子中的电子能进行两种运动：一种是围绕原子核的轨道运动，一种是围绕通过其中心的轴所作的自旋运动，两种运动分别产生轨道磁矩和自旋磁矩。当自由电子处于外加磁场B0中时，与外加磁场的相互作用将使电子的自旋能级从简并态分裂为两个能级，这就是电子自旋磁矩在外磁场中能量的塞曼分裂（Zeemansplitting）。如下图2所示。

图2

3.2吸收-弛豫-吸收过程

图3

3.3场调制

最广泛使用的连续调波EPR光谱的结果通常是表现测量吸收信号的一次微分值的谱线，这一过程是依靠一个外加的高频调制场来将吸收信号解析出来的。调制线圈缠绕在谐振腔的外侧，使产生的调制磁场方向与外加磁场一致。在慢速扫描的主磁场上再叠加一个高频、低幅的调制磁场，调制频率一般为100kHz。通过相敏检波器检测峰间幅值，可以获得到吸收信号的一次导数信号。

图4

由于这种场调制的方法使用了相敏检波器，仅有相同频率调制的信号（100kHz）可被检测到，这种采用了高频调制和相敏检波的检测方法能够显著提高信噪比。为了进一步提高仪器的分辨率，现代波谱仪还能观测二次微分曲线形式的测量结果。

4仪器结构

电子顺磁共振波谱仪主要由微波桥、电磁铁系统、传导系统、微波谐振腔、检测系统、调制系统构成。

微波桥：微波桥由产生、控制和检测微波辐射的器件组成。微波频率一般为1≤ν≤100GHz。常用的微波源有速调管和耿氏二极管。速调管在波谱仪中广泛作为微波源被使用，具有稳定、高能、噪声低的优势，能有效提高仪器分辨率。微波源后紧接着一个隔离调制器，用于减弱反射回源，维持微波频率的稳定。

图5

电磁铁系统：EPR光谱仪中的电磁铁系统要求能够提供强度符合需要的、稳定的、均匀的磁场，磁性组件包括磁体和磁场传感器。EPR光谱仪使用的磁体主要有两种：第一种是电磁体，通常能够产生高达1.5T的场强，适合在Q波段频率进行测量。第二种是超导磁体，适用于W波段和更高频率下进行操作。根据工作微波频率协调所需的磁场强度范围，从而进行磁体种类的选取。

传导系统：传导系统负责将产生的微波传导到指定位置，由隔离器、衰减器、环形器、波导管等重要器件连接而成。产生于微波源的电磁波通过定向耦合器被分成两条路径：一条路径指向谐振空腔，另一条路径指向参考臂。在两个路径上都有一个可变衰减器，能够精确控制产生微波的功率。在谐振空腔路径上，微波与样品相互作用，产生用于分析的共振吸收信号。在参考臂上，可变衰减器之后有一个移相器，可在参考信号和反射信号之间设定相位关系。

谐振腔：谐振腔好比EPR谱仪的心脏，它是一种方形或圆柱状的金属盒，用于放置样品、产生信号、放大信号、检测信号。样品放置在谐振腔中，产生的微弱信号在谐振腔内部通过共振被进一步放大，当能级分裂接近于入射微波光子的频率时，就能够通过固态二极管检测得出吸收线。谐振腔存储微波能量的能力由品质因数Q给出，Q值越高，光谱仪的灵敏度越高。

检测系统：载有信号的微波经环形器被传导出谐振腔，先经过检波后进入100kHz窄频带放大器，随后进入相敏检波器，在这里只检出与参考信号的频率与相位都相同的接收信号。相敏检波器输出的信号经过放大后送入电脑。

调制系统：大多数外部元件，如微波源发生器和检测器等都包含在微波桥接控制中，通过调制系统控制输入及输出的微波频率。调制系统的作用在于降低噪声、提高谱仪灵敏度。

4.1仪器工作原理

在EPR仪器中，电磁铁系统产生的磁场与经波导管传导至谐振腔的电磁波相互垂直，也与扫描线圈互相垂直。当电磁波的频率ν0和磁场强度H0满足共振吸收条件时，放置在谐振腔中的样品就要发生共振而吸收能量。吸收信号在谐振腔中被放大后，经过相敏检出放大后即可显示于示波器上，并被记录仪自动记录下来。

4.2制样要求

（1）气体样品的制备：

常见的气体样品如测试香烟中的自由基含量，主要的制样手段是对烟气进行富集，以达到测试需求的测试浓度。

（2）液体样品的制备：

①溶剂选择：对于极性大的溶剂，要将样品放在毛细管中进行测试，以避免溶剂对微波的吸收；

②除氧操作：液体中的氧气对信号的干扰非常大，因此需要对样品进行通氮或者真空除氧，以保证测试过程中能看到精细的结构信息；

未除氧

除氧

图6

③浓度控制：浓度过大或过小都会对样品信号造成干扰，导致精细结构的丢失，因此选择适当的浓度对测试结果有帮助。

（3）固体样品的制备：

①除潮处理：保护EPR图谱细节不受影响；

②样品粒径：要注意固体样品的颗粒大小，以免堵塞送样管；

③稀释操作：粉末样品的顺磁浓度如果太大也会对信号造成干扰，可以采用干燥硅胶或碳酸钙进行固体稀释。

（1）温度作用：温度对信号的影响主要体现在两个方面，一是热扰动对测试结果造成干扰；二是高温信号的存活时间较短，难以捕捉。因此一些诸如固体表面空穴检测、过渡金属的不稳定价态测试等都需要在液氮的低温环境中才能较好的采集到信号。

（2）样品浓度：样品浓度过高时分子间的距离较近，会使电子自旋-自旋相互作用更强，影响仪器分辨率；过低会接近仪器检出限，影响结果的灵敏度。因此需要采用分散剂，对样品浓度进行合适的调整。

图6不同干燥手法对EPR波谱的影响

图7

4.3影响因素

（3）磁场调制：磁场调制幅度过大或频率与谱线过于接近时会影响检波器的输出信号，引起谱线畸变失真。

（4）样品种类：确定样品种类及顺磁中心性质对调整微波频率与磁场场强有着重要的参考价值。比如水溶液中的样品，尤其是生物样品，主要通过介电过程吸收微波，而介电损耗在很大程度上受到频率的影响，因此为了保证能够有效观测到EPR信号，需要选择较低的微波频率。

5应用

EPR技术起源于物理学研究，但只要能在样品中形成未成对电子就能加以研究，其应用几乎遍及一切材料。

5.1蛋白质结构变化分析

在生物过程中存在着大量的自由基问题，如植物的光合作用、金属蛋白质的催化过程等。因此，电子顺磁共振波谱技术是在分子及细胞水平上研究生物医学问题的关键工具。由于蛋白质的结构与功能密切相关，当蛋白质进行生物学活动时，其构象就发生改变，因此可以通过研究蛋白质结构的变化对生物学过程进行分析。

图8

在采用EPR技术对生物学蛋白质大分子结构解析的过程中，可以采用自旋标记技术，逐点定位标记自由基，获取一系列EPR谱图，从谱图分析获取其二维结构，再辅以长程约束手段，最终获取完整的蛋白质结构信息。在此基础上，可以定点将标记探针引入感兴趣的位点，在不干扰蛋白质结构及功能的前提下，追踪蛋白质在生物活动中发生的构象改变。

AliseR.Muok等[6]就是根据上述实验思路，采用β修饰的二磷酸腺苷作为自旋标记探针，通过研究标记物侧链的动力学信息，对反应蛋白标记位点的周围环境和空间变化进行了研究。并且证实采用β修饰得到的ADP-β-S-SL是一种有效的进行双电子电子共振（DEER）光谱实验的探针工具。

5.2原位电化学过程研究

EPR光谱技术的一大特点是可在不影响物理、化学、生物反应过程的前提下对样品进行表征，因此具有原位表征的潜力。英国曼彻斯特大学的王斌等人[7]应用EPR技术对活性炭在水溶液中的电化学电容储存过程进行了原位检测。

实验结果表明，EPR信号强度和双积分值都随着充电过程而增加，随后在放电过程中可逆的恢复。

此外，综合EPR光谱线形及其温度依赖性分析得知，在活性炭的双电容行为中存在两种自旋行为：缺陷处的自旋，产生窄信号；表面芳族自旋，形成宽信号。在每种电解质溶液中都能够看到窄信号的电势依赖性响应，而宽信号的变化仅在较高浓度下发生。结果表明，窄信号的增加是由于官能团还原形成自由基，引起了未成对电子密度增加，宽信号的电势依赖性可能与离子进一步吸附到活性炭的深层多孔结构中有关。

图9

6新式仪器种类

传统EPR仪器采用的是固定微波频率、扫描磁场的方法，称为连续波-EPR（CW-EPR,continuouswave-EPR）仪器。近些年，随着附加器件的开发，发展出了脉冲-EPR和快速扫描-EPR技术，使EPR技术进入了多样化领域，能够获得更加多样的信息，样品测量范围进一步扩大。

6.1脉冲-EPR

脉冲波激发EPR技术实际上是一种弛豫测量工具，在脉冲波的激发下，自旋体系的弛豫现象被放大，能够提供有别于连续波激发共振的信息。

脉冲技术的实现只需对微波源器件进行简单的附件添加和调整。在微波源设置脉冲程序控制开关，就可以输出具有一定间隔的脉冲微波。脉冲EPR拥有多频、多共振和任意波形模式。脉冲-EPR的优势在于：能够提高g因子分辨率；放大微波功率；使用脉冲微波激发的共振跃迁信号无需经过磁场调制就能进行检测；改变激发电磁波的脉冲序列，可以获得有关顺磁化合物的更广泛信息。但与CW-EPR相比，脉冲-EPR无法激发得到整个光谱信息，且由于带宽更大，灵敏度受到限制。

图10

6.2快速扫描-EPR

快速扫描-EPR（RS-EPR,rapidscanning-EPR）技术结合了CW-EPR和脉冲-EPR的发声原理，更适合用于研究快速反应动力学。在快速扫描-EPR时，磁场在比电子自旋弛豫时间更短的时间内对样品进行共振扫描。

快速扫描信号的优势在于能够提供全谱检测，并且适用于在不饱和情况下提供更高的微波功率，尤其适合低频EPR成像；快速扫描EPR波谱能够同时测量自旋系统响应吸收和色散分量，可以显著提高信噪比。

与脉冲-EPR相比，快速扫描-EPR具有更高的灵敏度、更佳的空间分辨率、更短的采集时间，并能在单位时间内进行更多的临床前成像测量，这种技术对于进行临床体内研究尤其重要。

7展望

电子顺磁共振波谱是针对顺磁性物体进行结构分析与反应过程解析的有力表征方式，即使样品中不存在顺磁中心，也能够采用人工方法形成未成对电子，因此适用于广泛的样品种类。而且随着外加附件的研究与发展，电子顺磁共振技术的表征手段更加多样化，应用范围进一步拓宽。更重要的是，它是一门有效的原位表征技术，因此在研究致癌机理、临床反应、催化原理等过程及其中间产物问题时具有强大的分析能力。综上所述，电子顺磁共振波谱在生物医学、电化学等领域具有无穷的应用潜力。

参考文献

[1]L.R.Nobellectures,Physics:1901–1921(ElsevierPublishingCompany,Amsterdam,1967.500p.80guilders)[J].NuclearPhysicsA,1969,130(3):696-696.

[2]https://en.wikipedia.org/wiki/Zeeman_effect

[3]ProsserKE,WalsbyCJ.ElectronParamagneticResonanceasaToolforStudyingtheMechanismsofParamagneticAnticancerMetallodrugs[J].EuropeanJournalofInorganicChemistry,2016,2017.

[4]https://en.wikipedia.org/wiki/Electron_paramagnetic_resonance

[5]WilfredRaymondHagen.BiomolecularEPRspectroscopy[J].BiomolecularEprSpectroscopy,2014.

[6]MuokAR,ChuaTK,LeH,etal.NucleotideSpinLabelingforESRSpectroscopyofATP-BindingProteins[J].APPLIEDMAGNETICRESONANCE,2018.

[7]WangB,FieldingAJ,DryfeRAW.Insituelectrochemicalelectronparamagneticresonancespectroscopyasatooltoprobeelectricaldoublelayercapacitance[J].ChemicalCommunications,2018,54(31).

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